Molekularna biologija

Iz Wikipedije, proste enciklopedije
Skoči na: navigacija, iskanje

Molekularna biologija se ukvarja s proučevanjem genskega zapisa oziroma njegovega izražanja, prepisovanja. Področje molekularne biologije je zelo močno povezano in prepleteno z biokemijo, genetiko, genetsko tehnologijo, molekularno biotehnologijo in genskim inženirstvom.

Tehnike molekularne biologije[uredi | uredi kodo]

V molekularni biologiji se uporabljajo naslednje tehnike:

Kako izolirati nukleinske kisline?[uredi | uredi kodo]

  • Izolacija DNA

Najprimernejš vir so levkociti ali bele krvničke. Za postopek potrebujemo najmanj 30mL krvi, to nato damo v epruveto, ki vsebuje analizni agent. Dodamo hipotonično raztopino- to nam namreč omogoča, da se celice 'napijejo' vode in s tem razpočijo. Zanimivo pa je, da pri tem razpočijo le eritrociti ali rdeče krvničke, medtem ko levkociti ostanejo nedotaknjeni. Kri nato zberemo, centrifugiramo in operemo. Za uničenje notranje membrane uporabimo detergent ali natrijev docecilsulfat. Dodatek proteina K pa prispeva k uničenju proteinov in s tem osoboditvi molekule DNA. Dobimo torej raztopino DNA, ki vsebuje drobe, ki pa jih moramo očistiti. To naredimo z dodatkom fenola in kloroforma. Fenol namreč uniči proteine, kloroform pa raztopi organske delce. Ker nukleinske kisline, kamor spada tudi DNA ni so topne v organskem topilu, se razporedijo v vodno fazo. (gostota nukleinskih kislin je večja od 1).

V organski fazi se tako nahajajo lipidi in proteini, medtem ko so v vodni fazi nukleinske kisline.

Na koncu dodamo etanol (v hladnem), s tem oborimo DNA (prisotnost RNA lahko zanemarimo, saj je v večini uničena). DNA, ki jo dobimo s tem postopkom je stabilna.

  • Izolacija celotne RNA

Problem pri izolaciji RNA je, da je ta zelo hitro uničena z RNAzo (to je namreč encim, ki je zelo aktiven in odporen na vročino, zdrži namreč tudi do 1h pri 90 °C. Nahaja pa se pri vseh [bakterijah]). Paziti moramo predvsem na sterilnost. Postopek je podoben prejšnjemu. (glej Kako izolirati molekulo DNA?). Razlika je predvsem to, da moramo dodati DNAzo - saj le ta lahko uniči molekulo DNA, ter PROTEAZO, ki uniči proteine. Tako kot DNA se tudi RNA nahaja v vodni fazi. Da jo oborimo uporabimo etanol.

  • Izolacija mRNA

Ločevanje mRNA je malce težje, kot prej omenjeni postopki. Najprej moramo izolirati celotno RNA, po prej omenjenem postopku. mRNA ali sporočilna RNA ima posebnost na 3' koncu, saj tu vsebuje zaporedje več adeninov (to posebnost imenujemo poliA) Za ločevanje mRNA od preostale nukleinske kisline uporabimo gelsko kromatogradijo. Gel mora vsebovati nukleotide poliU ali poliT, saj se le omenjeni timin in uracil lahko povežeta z adeninom. Kot mobilno fazo uporabimo celotno RNA (ki smo jo že prej izolirali). Ker se mRNA veže na gel, pride do retenzije le te. Ostale nukleinske kisline pa potujejo hitro in se s tem izločijo. mRNA 'snamemo' s pomočjo ionske raztopine (raztopine, ki povzroči razpad vez med A-T in A-U). Tako kot vse ostale nukleinske kisline tudi to oborimo z etanolom.

Doziranje in ločevanje DNA in RNA[uredi | uredi kodo]

Posebnost nukleinskih kislin je, da je maksimalna absorbcija pri 260 nm (hkrati pa je absorbcija sorazmerna z količino nukleinskih kislin). Pri absorbciji uporabljamo enote 1DO.

1 DO: za 40 μg/L RNA
1 DO: za 25 μg/L DNA (enojna vijačnica)
1 DO: za 50 μg/L DNA (dvojna vijačnica)

Proteini imajo maksimalno absorbcijo pri 280 nm, fenol pa pri 270 nm. Če iščemo prisotne proteine, ki so vezani na DNA, moramo narediti dve meritvi; eno pri 280 in drugo pri 260 nm.

Če obstaja čista DNA potem je absorpcija med
(Za fenol je potrebno narediti posebno meritev, saj absorbira pri 270 nm)

1,8 < (DO 260/ DO 280) < 2

Za ločevanje uporabimo elektroforezo[uredi | uredi kodo]

NA GELU Hitrost je odvisna od števila baz na DNA (to pomeni, da je odvisna od PM, ter od koncentracije, ali z drugimi besedami: daljša je veriga manjša je hitrost premikanja molekul po gelu)

Poznamo različne gele:
a) poliakrilamid: če želimo ločiti delce DNA < od 1000pb
b) gel AGAROZE: za daljše delce (koncentracija gela je med 0,5 – 1,5 %) za dele z 0,5 – 20 kpb

ELEKTRIČNO POLJE Uporabimo gel agaroze 1 %, za ločevanje delcev nad 50kbp (Faza električnega polja se spreminja v času, kar omogoča ločevanje velikih delcev)

Omenjeni tehniki sta zelo dobri za določanje dolžine verige, predvsem pa zelo natančni. Dolžino verige lahko določimo tako, da poleg neznanega vzorca dodamo nukleinsko kislino znane dolžine, nato s pomočjo primerjave (grafa) odčitamo dolžino.

Graf elektroforeze[uredi | uredi kodo]

dovoli ločevanje dolžine DNA, ki je zelo natančna in najbolj uporabljena v Evropi. (dolžina potovanja je obratno sorazmerna z log števila baz)

Označevanje in odkrivanje nukleinskih kislin[uredi | uredi kodo]

Uporablja se etidijev bromid. Ta dovoli obarvanje nukleinskih kislin, ki so bile ločene z elektroforezo. Etidijev bromid je spojina, ki se vriva med baze nukleinske kisline, in jih s tem obarva. Spojina je kancerogena. Če nato uporabimo svetlobo UV pri 300 nm, ta spojina povzroča flouroscenco in seva oranžno barvo.

Centrifugacija[uredi | uredi kodo]

Uporabimo CeCl2, ki ima enako gostoto kot nukleinske kisline! Ta raztopina se razporedi glede na gostoto, ko dodamo nukleinske kisline –se postavijo na isto mesto!

Ko enkrat preverimo gostoto DNA, če je čista je med 1,4 in 1,5. Dodamo spojini, ki vsebujeta to gostoto, če je DNA vmes, pomeni, da je čista.

Sinteza oligonukleotidov z uporabo avtomata[uredi | uredi kodo]

Oligonukleotidi so zelo kratki delčki z nekaj nukleotidov. Nukleotidi so tako dodani v aparat v obliki β-cianoetilfosforamid. Prvi nukleotidi se vežejo na 3' mesto. Za vezavo drugega nukleotida je potrebno dodajati nukleotide, pri tem pa prvega aktivirati in hkrati zaščititi drugi konec, za tretjega pa moramo ponovno aktivirati zavarovani del drugega nukleotida,....

PCR (verižna polimerazna reakcija)[uredi | uredi kodo]

Je sinteza nukleotidov s pomočjo encimov. V zelo kratkem času, in sicer v 6 minutah se podvoji molekula DNA, količnina se tako množi eksponentno.

2 min pri 90 °C, ločevanje vijačnic 2 min pri 60 °C, dodatek delčka se bo vezal na 3' obeh vijačnic 2 min pri 60 °C, Tag polimeraza, podaljša ta dva dela

Za izvebo reakcije potrebujemo čisto DNA, Tag polimerazo (to je encim, ki deluje pri 90°C in prihaja iz bakterije 'thermus aquaticus', ki živi v vroči vodi), nukleotide in začetne oligonukleotide. Nukleotidi so v obliki trifosfata, za sintetizirati delčke, je potrebno poznati zaporedje na 3', ione Mg+2, optimalen pH, ki je med 8,3 in 8,8. Kot instrumente je nujno, da imamo aparaturo za gretje, kjer lahko reguliramo temperaturo in to na 2 minuti.

Prednosti te tehnike so, da lahko dodamo vse 'sestavine' hkrati in nato reguliramo le pH in temperaturo, to zelo olajša samo delo in zahtevnost reakcije. Druga prednost s nanaša predvsem na to, da v zelo kratkem času dobimo ogromno količino DNA. Kot primer: 1pg genskega materiala je zelo neprimeren za analizo, vendar če s pomočjo PCR sintetiziramo 200pg in to le v 20 krogih, tako količino že lahko analiziramo.

Problemi te tehnike se nanašajo predvsem na to, kako doličiti začetno zaporedje na 3', če le tega ne poznamo. To lahko naredimo na več načinov: lahko ugotovimo s pomočjo nastalih proteinov, lahko uporabimo zaporedje, ki se največkrat ponavlja v genomu določenih vrst. Lahko pa podaljšamo zaporedje DNA na prvotni molekulu z nekim znanim zaporedjem, in nato naredimo komplementarno zaporedje. Še večji problem pa je s čistostjo. To reakcijo pa je priporočljivo delati v mehurčku, ki je namenjem tej manipulaciji. Če se slučajno sintetiziramo aerosol, ki vsebuje DNA in imamo nukleinsko kislino tako povsod. Pred delom je zato priporočljivo dodati kapljico olja na vsako epruveto in paziti, da uporabljamo sterilen material. Tag polimeraza ima natančnost na 10−4. Dolžino same DNA ni težko analizirati, je pa zato težje analizirati mutacije. Če potrebujemo zelo natančno reakcijo je bolje uporabljati Pirokokus Furiosus, ki prav tako prenaša visoke temperature in ima hkrati večjo zanesljivost. Prav tako pa ostaja problem, kako lahko določimo količino na novo sintetizirane DNA.

Ko pa želimo sintetizirati le določen del DNA,moramo paziti, da se Tag polimeraza ne ustavi pred koncem. Kar lahko povemo je le, da je sinteza izven amorca aritmetična, medtem ko je sinteza željenega dela eksponentna.

Uporaba PCR postopka je pomembna,ko imamo premajhno količino DNA za analizo,v bakteriologiji ali virologiji, da sploh lahko določimo virus, ter v analizi in diagnozi genskih bolezni. Kot zanimivost lahko povemo, da vsebuje celica (7pg DNA), kapljica krvi (1,5 μg), neizpuljen las (0,3 μg), izpuljen las (10−4 μg), medtem ko za analizo potrebujemo vsaj (5 μg).