Z zanko posredovano izotermno pomnoževanje

Iz Wikipedije, proste enciklopedije
Jump to navigation Jump to search

Z zanko posredovano izotermno pomnoževanje (LAMP) je tehnika za pomnoževanje DNK[1][2] v eni epruveti in poceni alternativa za odkrivanje nekaterih bolezni. Izotermalna amplifikacija z zanko z obratno transkripcijo (RT-LAMP) združuje LAMP z obratno transkripcijo, kar omogoča odkrivanje RNK.

LAMP je tehnika izotermnega pomnoževanja nukleinskih kislin. V nasprotju s tehnologijo verižne reakcije s polimerazo (PCR), pri kateri reakcija poteka z vrsto izmeničnih temperaturnih korakov ali ciklov, izotermno pomnoževanje poteka pri konstantni temperaturi in ne zahteva termičnega ciklerja.

Tehnika[uredi | uredi kodo]

Pri LAMP se ciljno zaporedje amplificira pri konstantni temperaturi 60 - 65 °C z uporabo dveh ali treh nizov oligonukleotidnih začetnikov in polimeraze, ki ima poleg replikacijske aktivnosti tudi visoko aktivnost premikanja verig. Običajno se uporabljajo 4 različni oligonukleotidni začetniki za pomnoževanje 6 različnih področij ciljnega gena, kar povečuje specifičnost. Dodatni par "začetnih elementov z zanko" lahko reakcijo še dodatno pospeši.[3] Količina DNK, ki nastane pri pomnoževanju LAMP, je precej večja kot pri pomnoževanju na podlagi PCR.

Shema LAMP biomarkerjev nukleinskih kislin iz neobdelanih neobdelanih vzorcev odpadne vode za hitro kvantifikacijo mitohondrijske DNK (mtDNA), specifične za človeka.[4]

Produkt pomnoževanja je mogoče zaznati s fotometrijo, pri čemer se meri motnost, ki jo povzroča oborina magnezijevega pirofosfata v raztopini kot stranski produkt pomnoževanja.[5] To omogoča enostavno vizualizacijo s prostim očesom ali s preprostimi fotometričnimi pristopi za zaznavanje majhnih količin. Reakcijo lahko spremljamo v realnem času z merjenjem motnosti[6] ali s fluorescenco z uporabo interkalacijskih barvil, kot je SYTO 9.[7] Barvila, kot je zeleno SYBR, se lahko uporabijo za ustvarjanje vidne spremembe barve, ki jo je mogoče videti s prostim očesom, ne da bi potrebovali drago opremo, ali za reakcijo, ki jo je mogoče natančneje izmeriti z instrumenti. Molekule barvila interkalirajo ali neposredno označijo DNK, kar se lahko poveže s številom prvotno prisotnih kopij. Zato je LAMP lahko tudi kvantitativna.

V epruveti je mogoče zaznati pomnoževanje DNA LAMP z uporabo kalceina, obremenjenega z manganom, ki začne fluorescirati po kompleksaciji mangana s pirofosfatom med sintezo DNA in vitro.[8]

Druga metoda za vizualno zaznavanje amplikonov LAMP s prostim očesom temelji na njihovi sposobnosti hibridizacije s komplementarno z zlatom vezano ss-DNA in s tem preprečuje običajno spremembo rdeče v vijolično-modro barvo, do katere bi sicer prišlo med s soljo povzročeno agregacijo delcev zlata. Tako ima lahko metoda LAMP v kombinaciji z zaznavanjem amplikonov z AuNP prednosti pred drugimi metodami v smislu krajšega časa testiranja, potrditve amplikonov s hibridizacijo in uporabe preprostejše opreme (tj. ni potrebe po termociklerju, opremi za elektroforezo ali UV-transiluminatorju).[9][10]

Uporaba in prednosti[uredi | uredi kodo]

LAMP je razmeroma nova tehnika pomnoževanja DNK, ki bi lahko zaradi svoje preprostosti, robustnosti in nizkih stroškov zagotovila velike prednosti. LAMP se lahko uporablja kot preprost presejalni test na terenu ali na mestu oskrbe s strani zdravnikov.[11] Ker je metoda LAMP izotermna, kar odpravlja potrebo po dragih termociklerjih, ki se uporabljajo pri običajni PCR, je lahko še posebej uporabna metoda za diagnosticiranje nalezljivih bolezni v državah z nizkimi in srednjimi dohodki.[12] LAMP se pogosto preučuje za odkrivanje nalezljivih bolezni, kot so filarioza,[13] virus Zika,[14] tuberkuloza,[15] malarija,[16][17][18] spalna bolezen[19] in SARS-CoV-2.[20][21] V regijah v razvoju jo je treba še obsežno potrditi za druge pogoste patogene.[11]

Opazili so, da je LAMP v kompleksnih vzorcih, kot je kri, manj občutljiva (bolj odporna) na inhibitorje kot PCR, verjetno zaradi uporabe drugačne polimeraze DNA (običajno Bst - Bacillus stearothermophilus - polimeraza DNA in ne Taq polimeraza kot pri PCR). Več poročil opisuje uspešno odkrivanje patogenov iz minimalno obdelanih vzorcev, kot je toplotno obdelana kri,[22][23] ali v prisotnosti matric kliničnih vzorcev. [24] Ta lastnost LAMP je lahko uporabna v okoljih z nizkimi viri ali na terenu, kjer je običajna ekstrakcija DNK ali RNK pred diagnostičnim testiranjem nepraktična.

Omejitve[uredi | uredi kodo]

LAMP je manj vsestranska od PCR, najbolj uveljavljene tehnike pomnoževanja nukleinskih kislin. LAMP je uporaben predvsem kot diagnostična ali detekcijska tehnika, ni pa uporaben za kloniranje ali številne druge aplikacije molekularne biologije, ki jih omogoča PCR. Ker LAMP uporablja 4 (ali 6) primerje, ki so usmerjeni v 6 (ali 8) regij v dokaj majhnem segmentu genoma, in ker je načrtovanje primerjev podvrženo številnim omejitvam, je težko "na oko" načrtovati nabore primerjev za LAMP. Za pomoč pri načrtovanju primerjev LAMP se običajno uporabljajo brezplačni, odprtokodni[25] ali komercialni programski paketi, čeprav je zaradi omejitev pri načrtovanju primerjev izbira ciljnega mesta manjša kot pri PCR.

Pri diagnostični uporabi je treba to uskladiti s potrebo po izbiri ustrezne tarče (npr. ohranjenega mesta v zelo spremenljivem virusnem genomu ali tarče, ki je specifična za določen sev patogena). Za pokrivanje različnih variantnih sevov iste vrste je lahko potrebnih več degeneriranih zaporedij. Posledica takšnega koktajla primerjev je lahko nespecifična amplifikacija pri pozni amplifikaciji.

Pristopi multipleksiranja za LAMP so manj razviti kot za PCR. Večje število primerjev na tarčo pri LAMP povečuje verjetnost interakcij med primerji za multipleksirane ciljne sklope. Produkt LAMP je niz konkatemerov ciljne regije, kar na gelu povzroči značilno "lestev" ali vzorec pasov, ne pa enega samega pasu kot pri PCR. Čeprav to ni težava pri odkrivanju posameznih tarč z LAMP, pa "tradicionalne" (končne) aplikacije multipleksa PCR, pri katerih se identiteta tarče potrdi z velikostjo traku na gelu, z LAMP niso izvedljive. Multipleksiranje v LAMP je bilo doseženo z izbiro ciljne regije z restrikcijskim mestom in razgradnjo pred izvedbo na gelu, tako da vsak produkt povzroči različno velikost fragmenta,[26] čeprav ta pristop poveča zapletenost poskusne zasnove in protokola.

Uporaba polimeraze DNK, ki zamenjuje verige, pri LAMP prav tako onemogoča uporabo sond za hidrolizo, npr. sond TaqMan, ki temeljijo na 5'-3' eksonukleazni aktivnosti polimeraze Taq. Poročali smo o alternativnem pristopu multipleksiranja v realnem času, ki temelji na dušilcih fluorescence.[27]

Za prikaz LAMP v realnem času se lahko doda zeleno barvilo SYBR. Vendar lahko pri pozni amplifikaciji amplifikacija primer-dimerov prispeva k lažno pozitivnemu signalu. Uporaba anorganske pirofosfataze v reakcijski mešanici SYBR omogoča uporabo analize taljenja za razlikovanje pravilne amplifikacije.[28]

Čeprav so bile predlagane različne strategije za ublažitev lažno pozitivnih rezultatov pri testih, ki temeljijo na tej metodi, je nespecifično pomnoževanje zaradi različnih dejavnikov, vključno z odsotnostjo mehanizmov temperaturnega zapiranja, ena od glavnih omejitev izotermnega pomnoževanja z zanko.[29][30]

Sklici[uredi | uredi kodo]

  1. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T (2000). "Loop-mediated isothermal amplification of DNA". Nucleic Acids Res. 28 (12): 63e–63. doi:10.1093/nar/28.12.e63. PMC 102748. PMID 10871386.
  2. US patent 6410278, Notomi T, Hase T, "Process for synthesizing nucleic acid", objava prijave 2002-06-25, imetnik Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha 
  3. Nagamine K, Hase T, Notomi T (2002). "Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers". Mol. Cell. Probes. 16 (3): 223–9. doi:10.1006/mcpr.2002.0415. PMID 12144774.
  4. Yang, Zhugen; Xu, Gaolian; Reboud, Julien; Kasprzyk-Hordern, Barbara; Cooper, Jonathan M. (19 September 2017). "Monitoring Genetic Population Biomarkers for Wastewater-Based Epidemiology". Analytical Chemistry. 89 (18): 9941–9945. doi:10.1021/acs.analchem.7b02257. PMID 28814081.
  5. Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T (2001). "Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation". Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1): 150–4. doi:10.1006/bbrc.2001.5921. PMID 11708792.
  6. Mori Y, Kitao M, Tomita N, Notomi T (2004). "Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA". J. Biochem. Biophys. Methods. 59 (2): 145–57. doi:10.1016/j.jbbm.2003.12.005. PMID 15163526.
  7. Njiru ZK, Mikosza AS, Armstrong T, Enyaru JC, Ndung'u JM, Thompson AR (2008). "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for rapid detection of Trypanosoma brucei rhodesiense". PLOS Negl Trop Dis. 2 (1): e147. doi:10.1371/journal.pntd.0000147. PMC 2238707. PMID 18253475.
  8. Tomita N, Mori Y, Kanda H, Notomi T (2008). "Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products". Nat Protoc. 3 (5): 877–82. doi:10.1038/nprot.2008.57. PMID 18451795.
  9. Arunrut, Narong; Kampeera, Jantana; Sirithammajak, Sarawut; Sanguanrut, Piyachat; Proespraiwong, Porranee; Suebsing, Rungkarn; Kiatpathomchai, Wansika (2016). "Sensitive Visual Detection of AHPND Bacteria Using Loop-Mediated Isothermal Amplification Combined with DNA-Functionalized Gold Nanoparticles as Probes". PLOS ONE. 11 (3): e0151769. Bibcode:2016PLoSO..1151769A. doi:10.1371/journal.pone.0151769. PMC 4803327. PMID 27003504.
  10. Arunrut, Narong; Tondee, Benyatip; Khumwan, Pakapreud; Kampeera, Jantana; Kiatpathomchai, Wansika (February 2021). "Rapid and sensitive colorimetric detection of microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) based on spore wall protein (SWP) gene using loop-mediated isothermal amplification combined with DNA functionalized gold nanoparticles as probes". Aquaculture. 533: 736206. doi:10.1016/j.aquaculture.2020.736206.
  11. 11,0 11,1 Sen K, Ashbolt NJ (2011). Environmental microbiology : current technology and water application. Norfolk, UK: Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-70-7.[navedi št.strani]
  12. Macarthur G (2009). Global health diagnostics: research, development and regulation. Academy of Medical Sciences Workshop Report (PDF). Academy of Medical Sciences (Great Britain). ISBN 978-1-903401-20-0. Arhivirano iz prvotnega spletišča (PDF) dne 2018-05-16. Pridobljeno dne 2014-05-05.
  13. Poole, Catherine B.; Li, Zhiru; Alhassan, Andy; Guelig, Dylan; Diesburg, Steven; Tanner, Nathan A.; Zhang, Yinhua; Evans, Thomas C.; LaBarre, Paul; Wanji, Samuel; Burton, Robert A. (2017). "Colorimetric tests for diagnosis of filarial infection and vector surveillance using non-instrumented nucleic acid loop-mediated isothermal amplification (NINA-LAMP)". PLOS ONE. 12 (2): e0169011. doi:10.1371/journal.pone.0169011. ISSN 1932-6203. PMC 5310896. PMID 28199317.
  14. Calvert, Amanda E.; Biggerstaff, Brad J.; Tanner, Nathan A.; Lauterbach, Molly; Lanciotti, Robert S. (2017). "Rapid colorimetric detection of Zika virus from serum and urine specimens by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)". PLOS ONE. 12 (9): e0185340. doi:10.1371/journal.pone.0185340. ISSN 1932-6203. PMC 5612724. PMID 28945787.
  15. Geojith G, Dhanasekaran S, Chandran SP, Kenneth J (2011). "Efficacy of loop mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the laboratory identification of Mycobacterium tuberculosis isolates in a resource limited setting". J. Microbiol. Methods. 84 (1): 71–3. doi:10.1016/j.mimet.2010.10.015. PMID 21047534.
  16. Poon LL, Wong BW, Ma EH, Chan KH, Chow LM, Abeyewickreme W, Tangpukdee N, Yuen KY, Guan Y, Looareesuwan S, Peiris JS (2006). "Sensitive and inexpensive molecular test for falciparum malaria: detecting Plasmodium falciparum DNA directly from heat-treated blood by loop-mediated isothermal amplification". Clin. Chem. 52 (2): 303–6. doi:10.1373/clinchem.2005.057901. PMID 16339303.
  17. Ponaka, Reddy V. et al. | ASTMH 2015 | Molecular detection of Plasmodium with Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) and sensitivity comparison to PET-PCR assay | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_MalariaPoster2015-ASTMH_JT_rev3.pdf Arhivirano 2016-11-20 na Wayback Machine.
  18. Ponaka, Reddy V. et al. | AMP 2015 | http://www.ilmar.org.il/diasorin/MBI_AMP2015_MalariaPoster102715.pdf Arhivirano 2016-11-20 na Wayback Machine.
  19. Njiru ZK, Mikosza AS, Matovu E, Enyaru JC, Ouma JO, Kibona SN, Thompson RC, Ndung'u JM (2008). "African trypanosomiasis: sensitive and rapid detection of the sub-genus Trypanozoon by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of parasite DNA". Int. J. Parasitol. 38 (5): 589–99. doi:10.1016/j.ijpara.2007.09.006. PMC 7094514. PMID 17991469.
  20. Walker, Peter (21 May 2020). "UK coronavirus test with 20-minute wait being trialled". The Guardian.
  21. Park, Gun-Soo; Ku, Keunbon; Baek, Seung-Hwa; Kim, Seong-Jun; Kim, Seung Il; Kim, Bum-Tae; Maeng, Jin-Soo (2020). "Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2)". The Journal of Molecular Diagnostics. 22 (6): 729–735. doi:10.1016/j.jmoldx.2020.03.006. PMC 7144851. PMID 32276051.
  22. Sattabongkot J, Tsuboi T, Han ET, Bantuchai S, Buates S (2014). "Loop-mediated isothermal amplification assay for rapid diagnosis of malaria infections in an area of endemicity in Thailand". J. Clin. Microbiol. 52 (5): 1471–7. doi:10.1128/JCM.03313-13. PMC 3993686. PMID 24574279.
  23. Curtis KA, Rudolph DL, Owen SM (2008). "Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)". J. Virol. Methods. 151 (2): 264–70. doi:10.1016/j.jviromet.2008.04.011. PMID 18524393.
  24. Francois P, Tangomo M, Hibbs J, Bonetti EJ, Boehme CC, Notomi T, Perkins MD, Schrenzel J (2011). "Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications". FEMS Immunol. Med. Microbiol. 62 (1): 41–8. doi:10.1111/j.1574-695X.2011.00785.x. PMID 21276085.
  25. Torres C, Vitalis EA, Baker BR, Gardner SN, Torres MW, Dzenitis JM (2011). "LAVA: an open-source approach to designing LAMP (loop-mediated isothermal amplification) DNA signatures". BMC Bioinformatics. 12: 240. doi:10.1186/1471-2105-12-240. PMC 3213686. PMID 21679460.
  26. Iseki, Hiroshi; Alhassan, Andy; Ohta, Naomi; Thekisoe, Oriel M.M.; Yokoyama, Naoaki; Inoue, Noboru; Nambota, Andrew; Yasuda, Jun; Igarashi, Ikuo (December 2007). "Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites". Journal of Microbiological Methods. 71 (3): 281–7. doi:10.1016/j.mimet.2007.09.019. PMID 18029039.
  27. Tanner NA, Zhang Y, Evans TC (August 2012). "Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification". BioTechniques. 53 (2): 81–9. doi:10.2144/0000113902. PMID 23030060.
  28. Tone K, Fujisaki R, Yamazaki T, Makimura K (January 2017). "Enhancing melting curve analysis for the discrimination of loop-mediated isothermal amplification products from four pathogenic molds: Use of inorganic pyrophosphatase and its effect in reducing the variance in melting temperature values". J Microbial Methods. 132: 41–45. doi:10.1016/j.mimet.2016.10.020. PMID 27984058.
  29. Habibzadeh, Parham; Mofatteh, Mohammad; Silawi, Mohammad; Faghihi, Mohammad Ali; Ghavami, Saeid (2021). "Molecular diagnostic assays for COVID-19: an overview". Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 58 (6): 385–398. doi:10.1080/10408363.2021.1884640. PMC 7898297. PMID 33595397 Preveri |pmid= vrednost (pomoč).
  30. H Moehling, Taylor J; Choi, Gihoon; Dugan, Lawrence; Salit, Marc; Meagher, Robert (2021). "LAMP Diagnostics at the Point-of-Care: Emerging Trends and Perspectives for the Developer Community". Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1): 43–61. doi:10.1080/14737159.2021.1873769. PMID 33474990 Preveri |pmid= vrednost (pomoč).

Glej tudi[uredi | uredi kodo]

Viri[uredi | uredi kodo]