Uporabnik:Gregor nika/peskovnik

To je peskovnik uporabnika Gregor nika. Uporabnikov peskovnik je podstran uporabnikove strani. Služi testiranju in razvijanju strani in ni enciklopedični članek. Ustvari ali uredi svoj lastni peskovnik tukaj (primeren za testiranje z VisualEditorjem). Drugi peskovniki: Glavni peskovnik | Peskovnik v vadnici 1, 2, 3, 4, 5 | Peskovnik za predloge

Fluorescenčna spektroskopija

Spektroskopija preučuje snov na osnovi analize energije sevanja (elektromagnetno, mehansko ali delci) po stiku s snovjo. Fluorescenčna spektroskopija (poznana tudi pod imenom fluorometrija ali spektrofluorometrja) je vrsta elektromagnetne spektroskopije, ki analizira fluorescenco vzorca. Fokusiran žarek svetlobe (ponavadi UV) povzroči vzbujanje elektronov v molekulah v višja energijska stanja, le ti pa pri prehajanju nazaj v nižja stanja izsevajo fotone, a le del absorbirane energije se izseva kot svetloba, saj se nekaj energije vendo pretvori v toploto, zato ima izsevana svetloba daljšo valovno dolžino kot absorbirana.

Fluorescenčna spektroskopija se uprablja za raziskave na tkivih in v celicah, določanje oblike molekul, preučavanje zvijanja proteinov, vazava ligandov na proteine, hormonov na receptorje ipd. Fluorescenco se meri z fluorometri.

Fluorescenˇcna spektroskopija je eno osnovnih raziskovalnih orodij v biokemiji in biofiziki. V zadnjih dvajsetih letih se je uporaba fluorescence v bioloˇskih raziskavah znatno poveˇcala in se kot glavna metoda uporablja ˇse v biotehnologiji, medicinski diagnostiki, genski analizi, ipd. Dobra lastnost pri detektiranju fluorescence je visoka obˇcutljivost, ker fluorescenˇcni signal naˇceloma nima ozadja

 raziskave na tkivih, kjer lahko npr. raziskujemo termično poškodovanost le-teh pod vplivom radiofrekvenčnega polja. To lahko bistveno vpliva na natančno določanje obsega terapije, v primeru, bolezenskih stanj tkiv. Pomembna veja fluorescenčne spektroskopije je fluorescenčna korelacijska spektroskopija (FCS). To je občutljiva tehnika, razvita za študij dinamike procesov fluorescenčno označenih molekul pod ravnovesnimi pogoji. FCS meri fluktuacije fluorescenčne intenzitete v neki prostornini, ki jo določa fokusiran laserski žarek. Fluktuacije so lahko posledica difuzije fluorescenčno labeliranih molekul, dinamike kemijskih reakcij in drugih efektov. S korelacijo intenzitete fluktuacij lahko določimo lokalno koncentracijo, konstante kemijskih reakcij in hitrost difuzije.

Skica prehodov, če se vibracijska stanja prekrivajo ali ne. Na desni sliki se vibracijska stanja prekrivajo, zato se molekula v osnovno stanje vrne preko vibracijskih prehodov in ne fluorescira.

Toge molekule imajo manj vibracijskih energijskih stanj, zato se vibracijski nivoji v osnovnem in vzbujenem stanju ne prekrivajo in je prehod v osnovno stanje možen le s sevanjem - take molekule fluorescirajo. 

Fluorescenčna spektroskopija

Teorija

Molekule se nahajajo v različnih energijskih stanjih; za fluorescenčno spektroskopijo so najpomembnejši elektronski in vibracijski nivoji. Znotraj osnovenga in vzbujenih stanj molekule obstaja še več vibraijskih stanj. Molekula je z absorpcijo fotona vzbujena v višje energijsko stanje in neko vibracijsko stanje. Preden molekula izseva foton pri prehodu v nižje energijsko stanje najprej preide v nižja vibracijska stanja zaradi trkov z drugimi molekulami. Ta proces se karaktirizira s diagramom Jablonskega.

Nato vzbujena molekula s prehodom v osnovno elektrosnko stanje in neko vibracijsko stanje izseva foton. Ker je vibracijskih stanj mnogo so energije oziroma frekvence izsevanih fotonov drugačne. Z analizo frekvence in intenzitete na ta način izsevane svetlobe določimo strukturo različnih vibracijskih stanj.

The molecule then drops down to one of the various vibrational levels of the ground electronic state again, emitting a photon in the process. As molecules may drop down into any of several vibrational levels in the ground state, the emitted photons will have different energies, and thus frequencies. Therefore, by analysing the different frequencies of light emitted in fluorescent spectroscopy, along with their relative intensities, the structure of the different vibrational levels can be determined.

Vibracijski nivoji so lastnost molekul, saj vibracijska energija pride od relativnega nihanja atomov vezanih v molekulo. Tako za atome velja, da vibracijski nivoji ne obstajajo in zaradi tega je energija oziroma frekvenca izsevane svetlobe enaka absorbirani. Procesu, ko je izsevan foton enak absorbiranemu, se reče "resonantna fluoresceca". Ta je značilna za atomsko fluorescenco, toda opazijo se jo tudi pri fluorescenci molekul.

For atomic species, the process is similar; however, since atomic species do not have vibrational energy levels, the emitted photons are often at the same wavelength as the incident radiation. This process of re-emitting the absorbed photon is "resonance fluorescence" and while it is characteristic of atomic fluorescence, is seen in molecular fluorescence as well.

Pri tipičnem merjenju fluorsenčne emisije se meri emisijski spekter pri eni konstantni vzbujevalni valovni dolžini, in obratno pri merjenju fluorescenčne eksitacije. S podrobno meritvijo vzbujevalne in izsevane frekvence dobimo sevalni zemljevid (3-D diagram odvisnosti intenzitete od vzbujevalne in izsevane frekvence).

In a typical fluorescence (emission) measurement, the excitation wavelength is fixed and the detection wavelength varies, while in a fluorescence excitation measurement the detection wavelength is fixed and the excitation wavelength is varied across a region of interest. An emission map is measured by recording the emission spectra resulting from a range of excitation wavelengths and combining them all together. This is a three dimensional surface data set: emission intensity as a function of excitation and emission wavelengths, and is typically depicted as a contour map.

Fluorescenca

Fluorescence is the emission of light by a substance that has absorbed light or other electromagnetic radiation. It is a form of luminescence. In most cases, the emitted light has a longer wavelength, and therefore lower energy, than the absorbed radiation. The most striking example of fluorescence occurs when the absorbed radiation is in the ultraviolet region of the spectrum, and thus invisible to the human eye, while the emitted light is in the visible region, which gives the fluorescent substance a distinct color that can only be seen when exposed to UV light. Fluorescent materials cease to glow immediately when the radiation source stops, unlike phosphorescence, where it continues to emit light for some time after.

Fluorescence has many practical applications, including mineralogy, gemology, medicine, chemical sensors (fluorescence spectroscopy), fluorescent labelling, dyes, biological detectors, cosmic-ray detection, and, most commonly, fluorescent lamps. Fluorescence also occurs frequently in nature in some minerals and in various biological states in many branches of the animal kingdom.

Zgodovina

An early observation of fluorescence was described in 1560 by Bernardino de Sahagún and in 1565 by Nicolás Monardes in the infusion known as lignum nephriticum (Latin for "kidney wood"). It was derived from the wood of two tree species, Pterocarpus indicus and Eysenhardtia polystachya. The chemical compound responsible for this fluorescence is matlaline, which is the oxidation product of one of the flavonoids found in this wood.

In 1819, Edward D. Clarke and in 1822 René Just Haüy described fluorescence in fluorites, Sir David Brewster described the phenomenon for chlorophyll in 1833 and Sir John Herschel did the same for quinine in 1845.

In his 1852 paper on the "Refrangibility" (wavelength change) of light, George Gabriel Stokes described the ability of fluorspar and uranium glass to change invisible light beyond the violet end of the visible spectrum into blue light. He named this phenomenon fluorescence : "I am almost inclined to coin a word, and call the appearance fluorescence, from fluor-spar [i.e., fluorite], as the analogous term opalescence is derived from the name of a mineral." The name was derived from the mineral fluorite (calcium difluoride), some examples of which contain traces of divalent europium, which serves as the fluorescent activator to emit blue light. In a key experiment he used a prism to isolate ultraviolet radiation from sunlight and observed blue light emitted by an ethanol solution of quinine exposed by it.

Diagram Jablonskega

Z diagramom Jablonskega opišemo energije elektronskih stanj molekul in atomov. Za molekule velja, da imajo poleg vzbujenih elektronskih stanj tudi možne vibracijska in rotacijska stanja (posamezni atomi nimajo rotacijske in vibracijske energije v tem nivoju). Molekule imajo znotraj vsakega elektronskega nivoja še mnogo vibracijskih možnih stanj, vsako od teh z neko točno določeno energijo.

Diagram Jablonskega predstavlja elektronska stanja v fluoroforih in elektronske tranzicije med njimi.

Pomemben je tudi spin vzbujenega elektrona. Zaradi izbirnega pravila, ki prepoveduje elektronske prehode s sevanjem v tripletnem stanju, traja dlje časa da se vzbujen elektron vrne v osnovno stanje iz tripletnega stanja. To se lahko zgodi z kvadrupolnim sevanjem ali pa tako, da se molekula seva medtem, ko trči z drugo molekulo. S trkom oziroma sevanjem, ki ni dipolno, je zadoščeno da se vrtilna količina celotnega sistema ohranja. Trki so pravtako mehanizem, kako molekula preide med singletnim in tripletnim stanjem. nisem ekspert za singlete, triplete... mogoče je treba še kaj dodat. Ker je povprečen čas za prehod iz tripletnega stanja mnogo daljši od tistega za prehod iz singletnega, se pri molekulah, ki večinoma prehajajo iz tripletnega stanja ne opazi fluorescence, temveč fosfoerscenco.

Načini meritve

Fluorescenco merimo z optičnim sistemom (fluorometrom), ki omogoča analizo izsevane fouroscence.

Optični sistem sestoji iz svetila, ki vzbuja fluorescenco, monokromatorja (uklonske mrežice) ali filterjev za izbiro posamezne valovne dolžine vpadne in izsevane svetlobe in detektorja. Monokromator omogoča izbiro valovne dolžine vzbujevalne svetlobe in merjenje intenzitete posamezne valovne dolžine izsevane svetlobe. S pravo postavitvijo, lahko z eno uklonsko mrežico analiziramo vpadno in izsevano svetlobo.

Komercialni detektorji fluorescence (fluorometri) uporabljajo fotopomnoževalke za detekcijo svetlobe. Ker je spektralni razpon detektorja pogojen s tipom fotodiod, za merjenje izsevane fluorescenčne svetlobe izberemo takšnega, ki omogoča merjenje svetlobe pri valovni dolžini, kjer fluorescira vzorec. Detektor izsevane svetlobe je navadno postavljen pod kotom glede na vpadno svetlobo, tako da je v detektirani svetlobi prisotno čim manj prepuščene vpadne svetlobe, kar izbolšja SNR (signal-to-noise ratio) meritve.

Tipičen vsestranski fluorometer.

Za vzbujevalne fluorescence lahko uporabljamo različna svetila. Pri uporabi laserke svetlobe ne potrebujemo monokromatora, oziroma uklonske mrežice za vzujevalno svetlobo, saj že laserska svetloba zastopa le 0.01 nm intervala valovne dolžine. Za vpadni spekter enakomerne intenzitete v območju 300 – 800 nm uporabljamo ksenonsko žarnico. Uporabljamo lahko tudi druga svetila, npr.: LED in druge plinske svetilke.

Najbolj vsestranski fluorometri so z monokromatorjem za analizo vpadne in izsevane svetlobe, in svetilom s širokim spektrom, ki lahko vzbuja v celem fluorescenčen absorbcijskem spektru.

Analiza spektralnih podatkov

Pri merjenju fluorescence je potrebno upoštevati tudi druge pojave, ki kvarijo meritve. Faktorje, ki kvarijo signal so lahko povezani s optičnim sistemom, oziroma merilno napravo, ali pa s vzorcem, katerega se meri.

Pojavi, poleg fluorescence, ki kvarijo dobljen signal

Pri majhnih koncentracijah fluoroforov, je merjena intenziteta porporcialna koncetraciji. Pri večjih vzorcih pride do reabsorbcije fluorescenčne svetlobe, temu prispevajo druge molekule, ki absorberajo svetlobo v območju, kjer fluorofori sevajo, in pri večjih koncentracijah fluoroforov z večkratnim absorbiranjem in sevanjem kvarijo spekter. Zaradi absorbcije je izmerjena fluroscenca različna na različnih mestih vzorca. Če je koncentracija fluoroforov prevelika lahko zaradi reabsorbcije celo napačno presodimo, da vzorec ni fluorescenten.

Fluorescenca vzorca se s časom manjša zaradi fotodekompozicije fluroforov (bleaching), kar pomeni da zaradi dolgoživega tripletnega stanja se število molekul, ki fluorescirajo manjša. Če uporabljamo kvantne pike, do tega pojava ne pride.

Do detektorja pride tudi svetloba, ki se od vzorca sipa. Moteče sipane svetlobe največ pride od Rayleighovega in Ramanovega sipanja. Razlikujeta se predvsem v intenziteti, saj je ramanovega sipanja manj in v valovni dolžini sipane svetlobe. Pri ramanovem sipanju gre predvsem za sipanje na virtualih stanjih elektronov, zaradi česar, tako kot pri fluorscenci sipana svetloba lahko izgubi nekaj energija na račun vibracijskih prehodov molekule (Raman – stokes). Pride lahko tudi do povečanja energije elektrona, če le ta odnese nekaj vibracijske energije (raman – antistokes).

Inšturemntalne napake

Izvor svetlobe s katerim osvetljujemo se s časom spreminja. Intenziteta in spekter se med meritvijo in med posameznimi meritvami spreminjata. Zaradi tega se ponavadi svetlobo iz svetila s beam splitterjem razdeli na dva veji. En žarek vzbuja fluorescenco, drugi žarek pa uporabljamo kot referenco, tako, da osvetljuje referenčni vzorec. Zaradi tega ponavadi potrebujemo tudi dva detektorja namesto enega.

Zaradi neidealnosti optičnih elementov, kot je neničelna prepustnost monokromatorja za valovne dolžine, ki jih ne želimo, da vplivajo na vzorec oziroma na detektor. Zaradi staranja detektorja se spreminja njegov kvantni izkoristek in njegov odziv na različne valovne dolžine. Upoštevati je potrebno tudi optične lastnosti drugih optičnih elementov ter kivete ali celice, oziroma posode s vzorcem. Za ta namen je primerno kvarčno steklo, saj prepušča svetlobo od 200 do 2500-3500 nm, kar je interval, kjer se ponavadi opazuje fluroscenco. Drugi materiali lahko fluorescenco absorbirajo.

Pri geometrijski postavitvi detektorja za izogibanje prepuščene svetlobe je lahko pri visokih koncentracijah fluoroforov potrebno tudi upoštevati, da se fluorescenca vzorca vzolž vpadne svetlobe razlikuje s pozicijo. Merjenjev vzorcev z visoko absorbcijo zahteva merjenje fluorescence na sprednji površini. Občutljivost detektorja (fotopomnoževalk) je odvisna od temni tok, ki je odvisen od temperature, zaradi česar je detektor za natančne meritve in izbolšanje SNR-ja potrebno hladiti. Temu se lahko izognemo tudi z uporabo stroboskopa, kot svetlobnega izvora. Velika intenziteta bliskov povzroči močnejšo fluorcenco in izbolšanje SNR-ja. V ta namen ne moremo uporabljati kontinuiranih izvorov velike intenzitete, saj pride do fotodekompozicije fluroforov.

Viri

1. J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 3rd edition (Springer, Berlin, 2008).
2. http://www-f1.ijs.si/~ziherl/FluorescencnaSpektroskopija.pdf
3. http://student.pfmb.uni-mb.si/~puntar/fluorescencna_spektroskopija.html
4. C. D. Geddes in J. R. Lakowicz, Reviews in fluorescence 2006 (Springer, Berlin, 2007).
5. M. Sauer, J. Hofkens, J. Enderlein. Handbook of Fluorescence Spectroscopy and Imaging: From Single Molecule to Ensembles. 2011 (WILEY-VCH, Weinheim)
6. https://www.chem.uci.edu/~dmitryf/Fundamentals/Fluorescence%20Spectroscopy.pdf