Genska elektrotransfekcija

Genska elektrotransfekcija je biotehnološka metoda, ki omogoča vnos genskega materiala v prokariontske in evkariontske celice. Temelji na principu fizikalne metode, elektroporacije, ki z uporabo visokonapetostnih in kratkih električnih pulzov povzroči začasno povečano prepustnost celične membrane. Tako lahko v celico vnašamo tudi večje molekule (plazmidno DNA, oligonukleotide, kratko interferenčno RNA), ki drugače ne prehajajo celične membrane. Začetki genske elektrotransfekcije segajo v zgodnja osemdeseta leta[1] in danes je zaradi svoje učinkovitosti in preproste uporabe postala rutinska metoda za vnos genov v bakterijske,[2] kvasne, [3] rastlinske[4] in živalske celice[5] in vitro, ter v različna tkiva, kot so mišice,[6] tumorji,[7] jetra[8] in koža[9] in vivo.

Fizikalni princip

genska elektro-transfekcija

Izpostavitev celice dovolj visoki jakosti električnega polja privede do povečanja transmembranske napetosti, kar povzroči začasno povečano prepustnost membrane. Tako je v celico mogoče vnesti molekule, ki jih membrana v normalnih pogojih ne prepušča.[10] Natančni mehanizmi genske elektrotransfekcije še vedno niso popolnoma pojasnjeni. Znano je, da se v prisotnosti zunanjega električnega polja DNA nakopiči le na tistem delu membrane celice, ki se nahaja na strani katode in da so za uspešnost metode potrebni številni koraki: elektroforetsko gibanje DNA proti celici, prenos DNA skozi celično membrano, migracija DNA po citoplazmi celice do celičnega jedra, prenos skozi jedrno ovojnico in nato izražanje gena.[11] Na učinkovitost genske elektrotransfekcije vpliva vrsta dejavnikov, med drugimi: temperatura, parametri električnih pulzov, koncentracija DNA, sestava elektroporacijskega medija, velikost celice in njena sposobnost izražanja vnesenega gena.[12] V in vivo okolju pa na učinkovitost genske elektrotransfekcije vplivajo tudi mobilnost DNA v zunajceličnem ogrodju, struktura in prevodnost tkiva.[13]

Uporaba v biotehnologiji

Velike količine specifičnega proteina za biotehnološke ali medicinske namene najlažje pridobimo s transformacijo bakterij. Ker je genska elektrotransfekcija preprosta, hitra in učinkovita metoda, bi lahko kaj kmalu popolnoma zamenjala ostale metode transformacij bakterij.[14]

Uporaba v medicini

Prvič so elektroporacijo v medicini uporabili za vnos slabo prehodnih protitumorskih učinkovin v nodule tumorjev.[15] Kmalu je tudi genska elektrotransfekcija zaradi nizke cene, preprostosti in varnega načina vnosa genskega materiala vzbudila veliko pozornosti. Pri vnosu genskega materiala z virusnimi vektorji se še vedno namreč pojavlja vprašanje varnosti zaradi možnosti prekomernega odziva gostiteljevega imunskega sistema ali potencialne patogenosti vnesenih virusov.[16] Za vnos genov in vivo se genska elektrotransfekcija uporablja že od leta 1991[17] in danes je v teku velika kopica predkliničnih študij genske elektrotransfekcije. Z vnosom številnih terapevtskih genov z dovajanjem električnih pulzov v različna tkiva se poraja možnost za zdravljenje različnih bolezni, kot so: motnje imunskega sistema, metabolne motnje, monogenetske bolezni, kardiovaskularne bolezni, analgezije….[18][19][20] Zaključena pa je že tudi prva klinična študija faze I vnosa terapevtskega gena z gensko elektrotransfekcijo.[21] Študija je potekala pri pacientih z metastatsko obliko melanoma, kjer so vnašali z električnimi pulzi plazmid, ki kodira gen za interlevkin-12 (pIL-12). Pri pacientih so spremljali varnost, toleranco in učinek terapije. Zaključki raziskave so bili, da je genska elektrotransfekcija s pIL-12 varna in dobro tolerirana ter da je opaziti delno ali popolno regresijo oddaljenih in netretiranih melanomov, kar kaže na sistemski učinek terapije. Na podlagi rezultatov že načrtujejo prehod k študiji klinične faze II. Trenutno je v teku več kliničnih študij genske elektrotransfekcije[22], kjer spremljajo varnost, toleranco in učinkovitost imunizacije z DNA cepivom, ki ga vnašajo z električnimi pulzi. Čeprav metoda ni sistemska, temveč le lokalna, predstavlja še vedno najbolj učinkovito alternativo virusni transfekciji.

Literatura

1. Neumann E, Schaefer-Ridder M, Wang Y, Hofschneider PH (1982). Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields, EMBO J 7:841–845

2. Drury L (1996). Transformation of bacteria by electroporation, Methods Mol Biol 58: 249–256

3. Simon JR (1993). Transformation of intact yeast cells by electroporation, Methods Enzymol 217:478–483

4. Terzaghi WB, Cashmore AR (1997). Plant cell transfection by electroporation, Methods Mol Biol 62:453–462

5. Kanduser M, Miklavcic D, Pavlin M (2009). Mechanisms involved in gene electrotransfer using high- and low-voltage pulses –An in vitro study, Bioelectrochemistry 74:265–271

6. Aihara H, Miyazaki J (1998). Gene transfer into muscle by electroporation in vivo, Nat Biotechnol 16:867–870

7. Cemazar M, Sersa G, Wilson J, Tozer GM, Hart SL, Grosel A, Dachs GU (2002). Effective gene transfer to solid tumors using different nonviral gene delivery techniques: Electroporation, liposomes, and integrin-targeted vector, Cancer Gene Ther 9:399–406

8. Heller R, Jaroszeski M, Atkin A, Moradpour D, Gilbert R, Wands J, Nicolau C (1996). In vivo gene electroinjection and expression in rat liver, FEBS Lett 389:225–228

9. Pavselj N, Preat V (2005). DNA electrotransfer into the skin using a combination of one high– and one low–voltage pulse, J Control. Release 106:407–415

10. Kotnik T, Miklavcic D (2000). Analytical description of transmembrane voltage induced by electric fields on spheroidal cells, Biophys J 79:670–679

11. Satkauskas S, Bureau MF, Puc M, Mahfoudi A, Scherman D, Miklavcic D, Mir LM (2002). Mechanisms of in vivo DNA electrotransfer: respective contributions of cell electropermeabilization and DNA electrophoresis, Mol Ther 5:133–140

12. Gehl J (2003). Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research, Acta Physiol Scand 177:437–447

13. Miklavcic D, Beravs K, Semrov D, Miklavcic D, Cemazar M, Demsar F, Sersa G (1998). The importance of electric field distribution for effective in vivo electroporation of tissues, Biophys J 74:2152–2158

14. Calvin NM, Hanawalt PC (1988). High-efficiency transformation of bacterial cells by electroporation, J Bacteriol 170:2796–801

15. Mir LM, Belehradek M, Domenge C, Orlowski S, Poddevin B, Belehradek J Jr, Schwaab G, Luboinski B, Paoletti C (1991). Electrochemotherapy, a new antitumor treatment: first clinical trial, CR Acad Sci III 313:613–618

16. Marshall E (1999). Gene therapy death prompts review of adenovirus vector, Science 286:2244–2245

17. Titomirov A, Sukharev S, Kistanova E (1991). In vivo electroporation and stable transformation of skin cells of newborn mice by plasmid DNA, Biochim Biophys Acta. 1088(1):131–134

18. Heller LC, Coppola D (2002). Electrically mediated delivery of vector plasmid DNA elicits an antitumor effect, Gene Ther 9:1321–1325

19. Chuang IC, Jhao CM, Yang CH, Chang HC, Wang CW, Lu CY, Chang YJ, Lin SH, Huang PL, Yang LC (2004). Intramuscular electroporation with the proopiomelanocortin gene in rat adjuvant arthritis, Arthritis Res Ther 6:R7–R14

20. Vilquin JT, Kennel PF, Paturneau-Jouas M, Chapdelaine P, Boissel N, Delaère P, Tremblay JP, Scherman D, Fiszman MY, Schwartz K (2001). Electrotransfer of naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies, Gene Ther 8:1097–1107

21. Daud A, DeConti R, Andrews S, Urbas P, Riker A, Sondak VK, Munster PN, Sullivan DM, Ugen KE, Messina JL, Heller R (2008). Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma, J Clin Oncol 26(36):5896–5903

22. http://clinicaltrials.gov